Molekularne techniki analizy RNA

fakultatywne

Genetyka molekularna 1400-215GEBM
Genetyka z inżynierią genetyczną 1400-114GEN

Student powinien posiadać podstawową wiedzę z zakresu biologii molekularnej, co najmniej w zakresie realizowanym w ramach przedmiotu "Genetyka z inżynieria genetyczną D". Dobrze, ale nie jest to warunek konieczny, gdy student wcześniej zaliczył fakultet dot. technik molekularnych, np. "Genetyka molekularna".

Konieczne umiejętności praktyczne - podstawy pracy laboratoryjnej: praca sterylna z hodowlami mikrobiologicznymi, obsługa pipet automatycznych, elektroforeza w żelach agarozowych, przygotowywanie prostych reakcji enzymatycznych (PCR).

Mile widziana ciekawość "Świata RNA".

Przedmiot jest skierowany do studentów wszystkich kierunków Wydz. Biologii UW, zainteresowanych metabolizmem RNA oraz nowoczesnymi, molekularnymi technikami wykorzystywanymi w badaniu RNA.

Wykłady:

1. „Świat RNA”

Koncepcja „RNA world”. Nagrody Nobla w dziedzinie RNA. Katalityczne cząsteczki RNA – klasy, mechanizm, występowanie. SELEX. Pozostałości świata RNA - rybosom, splajsosom, wirusy RNA. Różnorodność klas RNA u Eukaryota i ich metabolizm. Podstawowe mechanizmy regulacji ekspresji genów.

2. „Przegląd technik opartych o odwrotną transkrypcję“

Teoria odwrotnej transkrypcji (RT). Przegląd technik opartych o RT: RT-PCR w tym półilościowy, pulsacyjny RT-PCR, RACE, cRT-PCR, technika wydłużania startera ("primer extension").

3. „Techniki badania transkrypcji: TRO, ChIP, RIP i DIP. Analiza końców poliA RNA“

Techniki badania nowopowstajacych transkryptów: jądrowy „Transcription Run-On“, immunoprecypitacja chromatyny (ChIP), immunoprecypitacja RNA (RiP). Do zilustrowania powyższych techniki posłużą badania terminacji transkrypcji Polimerazy I RNA. Specyficzność wiązania DNA przez czynniki transkrypcyjne: „ChIP on chip“, immunoprecypitacja DNA (DIP). Badanie końców poliA RNA (technika PASE, izolacja frakcji RNA poliA+).

4. „Biogeneza małych RNA (sRNA)”

Podział sRNA ze względu na ich biogenezę i funkcje. Ścieżki syntezy sRNA. Udział sRNA w różnorodnych mechanizmach interferencji RNA u nicieni, ssaków i roślin.

5. „Rola chromatyny w regulacji ekspresji genów”

Struktury subjądrowe, budowa nukleosomu, histony i ich modyfikacje. Czynniki remodelujące chromatynę, czynniki transkrypcyjne. Rola stanów chromatyny – euchromatyny i heterochromatyny – w transkrypcji. Mechanizmy wyciszania transkrypcji: RNAi, antysensowny RNA. Kompleksy RNP biorące udział w wyciszaniu transkrypcji.

6. „Inne niekodujące RNA (ncRNA)”

Struktura, synteza i funkcje wybranych ncRNA w regulacji ekspresji genów. Wszechobecna transkrypcja genomów. CUT, SUT, PROMTP etc. – transkrypcyjny hałas czy funkcjonalne cząsteczki? Kontrola jakości ncRNA. ncRNA w medycynie – choroby skorelowane z defektami w syntezie i działaniu ncRNA.

7. „PCR w czasie rzeczywistym (ilościowy; qPCR)”

Teoria qPCR: sposoby detekcji DNA, podstawy projektowania starterów, sondy hybrydyzacyjne, wprowadzenie do obliczeń. Zastosowania: określanie poziomu badanych transkryptów w komórce, wykrywanie kwasów nukleinowych patogenów, detekcja pojedynczych mutacji (SNP). Dobra praktyka laboratoryjna przy doświadczeniach qPCR i najczęstsze „pułapki czekające” na eksperymentatorów.

8. „Udział metabolizmu RNA w procesach fizjologicznych”

Czynniki metabolizmu RNA i miRNA u roślin – rola w przekazywaniu sygnałuów hormonalnych, rozwoju embrionalnym i generatywnym, zegarze dobowym, odporności na stres i patogeny.

9. „Globalne analizy kompleksów rybonukleoproteinowych“

Metody biochemiczne czyszczenia kompleksów rybonukleoproteinowych (RNP). Drożdżowy system trzyhybrydowy. Chromatografia RNA w połączeniu ze spektroskopią mas. CRAC („crosslinking and analysis of cRNA“) i CLIP („crosslinking and immunoprecipitation“).

10. „Struktura RNA a funkcja. Mapowanie struktury RNA in vitro. Metody badania transkryptomów”

Fałdowanie RNA. Mapowanie struktury RNA in vitro: sondy molekularne trawiące specyficznie względem struktury i sekwencji RNA. Rybozymy. Przełączniki RNA i aptamery – naturalne oraz wyselekcjonowane na potrzeby leków lub biosensorów. Metody badania transkryptomów (mikromacierze, "deep-sequencing").

11. „Biologia strukturalna i bioinformatyka RNA”

12. „Badanie enzymów metabolizmu RNA na przykładzie egzosomu”

Ścieżki rozkładu RNA w organizmach eukariotycznych. Egzo- i endo- nukleazy. Egzosom: wielofunkcyjny i wieloskładnikowy kompleks. Badania strukturalne i funkcjonalne egzosomu u drożdży i w komórkach ludzkich. Mechanizm działania, współpraca aktywności egzo- i endo-nukleolitycznej.

13. „RNowe nowości”

Nowe klasy ncRNA. RNAi u drożdży Saccharomyces cerevisiae? Fragmenty RNA powstałe z rozkładu stabilnych RNA. Nietypowe funkcje RNP.

Część wykładów będzie prowadzona przez zaproszonych gości.

Ćwiczenia:

1. Podstawy pracy z RNA. Izolacja RNA z drożdży i z roślin.

2. Ocena jakości RNA. Rozdział w żelach, elektroforeza kapilarna. Radioizotopowe i fluorescencyjne metody detekcji RNA. Detekcja rybosomalnego RNA (rRNA) u drożdży i roślin: technika Northern-blot (1) z rozdziałem RNA w żelu agarozowym.

3. Technika Northern-blot (1): hybrydyzacja z sondą oligonukleotydową znakowaną radioizotopowo kinazą lub oligonukleotydami znakowanymi fluorescencyjnie. Wirtualny Northern-blot. Detekcja miRNA u roślin - wprowadzenie.

4. Analiza wyników Northern-blot (1) (skan i omówienie). Wykrywanie transkryptów CUT u drożdży: technika Northern-blot (2) z rozdziałem RNA w żelu poliakrylamidowym. Detekcja miRNA u roślin: reakcja RT.

5. Detekcja miRNA u roślin: reakcja PCR na matrycy cDNA, analiza produktów w żelu agarozowym. Detekcja CUT u drożdży: znakowanie sondy metodą "random-priming" i hybrydyzacja.

6. Detekcja CUT u drożdży: omówienie wyników hybrydyzacji Northern-blot (2). Analiza 3' końców małych jąderkowych RNA (snoRNA) przy pomocy cRT-PCR. Cięcie Rnazą H dupleksów RNA-oligonukleotyd i ligacja (cyrkularyzacja) RNA.

7. Analiza 3' końców snoRNA: RT + PCR.

8. cRT-PCR: rozdział produktów w żelu i omówienie ich sekwencjonowania. Wykrywanie prekursorów i dojrzałych mRNA metodą RT-qPCR. Przeprowadzenie RT. Projektowanie starterów do qPCR - teoria i praktyka. Konkurs na najwydajniejszą parę starterów.

9. Przeprowadzenie reakcji qPCR: analiza poziomu mRNA genu reporterowego u drożdży oraz testowanie zaprojektowanych starterów dla genów referencyjnych.

10. Analiza wyników reakcji qPCR.

11. Oddziaływania białka - kwasy nukleinowe. Wiązania drożdżowego białka Nsi11 z rDNA. Teoria: ekspresja i oczyszczanie białka Nsi11 oraz fluorescencyjny "gel-shift" (inkubacja prób, rozdział w natywnym żelu poliakrylamidowym).

12. Wyniki doświadczenia "gel-shift". Oznaczenia biochemiczne aktywności enzymów degradujących RNA. Analiza aktywności rybonukleolitycznych róznych wersji białka Dis3 - głównej podjednostki katalitycznej kompleksu egzosomu; badanie wrażliwości aktywności egzorybonukleolitycznej 5'-3' białka Xrn1 na status fosforylacji końca 5' substratu; reakcje degradacji syntetycznych oligonukleotydów RNA znakowanych fluorescencyjnie, rozdział produktów reakcji w denaturującym żelu poliakryloamidowym.

13. Oznaczenia biochemiczne aktywności enzymów degradujących RNA - analiza wyników. Projektowanie amiRNA. Konsultacje przed prezentacjami.

14. Prezentacje studentów na zaliczenie ćwiczeń.

Skrypt do zajęć oraz podręczniki „Genomy” T. Brown, „Genetyka molekularna” red. P. Węgleński; literatura uzupełniająca: publikacje naukowe (doświadczalne i przeglądowe) wskazane w trakcie zajęć przez prowadzących; „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” J. Sambrook i D. Russel.

Ma wiedzę na temat metabolizmu RNA u Eukariota.

Zna etapy ekspresji różnych klas RNA, ze szczególnym naciskiem na procesy współ- i po-transkrypcyjne, potrafi podać przykłady oddziaływań RNA - białko oraz zaangażowania cząsteczek RNA w procesy fizjologiczne.

Ma wiedzę dotyczącą enzymów modyfikujących RNA.

Posiada wiedzę teoretyczną i praktyczną pozwalającą na interpretowanie zjawisk i procesów związanych z metabolizmem RNA w oparciu o wyniki doświadczalne.

Samodzielnie planuje i przeprowadza podstawowe typy doświadczeń.

Zna słownictwo dot. metabolizmu RNA zarówno w jęz. polskim jak i angielskim, potrafi komunikować się i podejmować dyskusję na tematy związane z metabolizmem RNA.

Zna teoretyczne podstawy technik molekularnych wykorzystywanych do badania RNA, w stopniu pozwalającym na zrozumienie publikacji naukowych z tej dziedziny.

Potrafi krytycznie analizować otrzymane dane i je rzetelnie prezentować, co przyczynia się do podtrzymywania etosu zawodowego i rozwija zasady etyki zawodowej.

Warunki zaliczenia ćwiczeń.

Zajęcia zaliczone mogą być jedynie, jeśli student uczestniczył w nie mniej jak 85% zajęć.

Ćwiczenia zaliczane są na ocenę. Na ocenę składają się punkty uzyskane za prezentacje przedstawiane przez studentów, dotyczące publikacji naukowych, w których stosowano techniki badania RNA (waga w końcowej ocenie - 2/3) oraz punkty uzyskane z prac domowych (waga w końcowej ocenie - 1/3).

Warunki egzaminu końcowego z całego przedmiotu.

Przedmiot zaliczany jest na ocenę.

Do egzaminu może przystąpić jedynie student, który zaliczył ćwiczenia.

Egzamin testowy: test jednokrotnego wyboru (4 warianty odpowiedzi na każde pytanie).

Aby zaliczyć egzamin student musi uzyskać nie mniej jak 50% punktów.

Nie są wymagane.

Warunki przyjęcia na zajęcia

Pierwszeństwo w przyjmowaniu mają studenci I roku studiów MU w

szczególności studenci wykonujący prace magisterskie lub licencjackie w

Instytucie Genetyki i Biotechnologii UW.

Wymagane przedmioty - dla studentów I roku studiów MU:

1. Genetyka z inżynierią genetyczną D” (1400-114GEN);

2. Genetyka molekularna (1400-215GEBM) lub Biologia molekularna (1400-215BM) lub Biologia molekularna roślin (1400-216MR).

Wymagane jest podanie ocen z powyższych przedmiotów (zaliczenia i egzaminu).

Wymagane przedmioty - dla studentów III roku studiów I stopnia (licencjackich):

1. Genetyka z inżynierią genetyczną D (1400-114GEN);

2. Biochemia D (1400-113BCH).

Wymagane jest podanie ocen z powyższych przedmiotów (zaliczenia i egzaminu).

Informację o ocenie/ocenach i/lub preferencjach grup zajęciowych należy

uzupełnić na załączonym formularzu: https://forms.gle/y5T6dtjxXHXRWvEq6